BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Udang
vannamei (Litopenaeus vannamei) merupakan primadona budidaya air payau pada
saat ini. Udang vannamei merupakan udang yang memiliki nilai ekonomi tinggi dan
merupakan salah satu komoditas ekspor. Pembudidayaan udang vannamei di
Indonesia mengalami perkembangan yang sangat pesat, terutama di Lampung, Jawa
Timur dan Bali. Pesatnya perkembangan budidaya udang vannamei di berbagai
tempat,dikarenakan udang vannamei memiliki beberapa keunggulan yaitu
pertumbuhan lebih cepat, ukuran panen yang lebih seragam, relatif tahan dengan
serangan penyakit, dan memiliki produktivitas per satuan luas lahan lebih
tinggi. Introduksi udang vannamei (L. vannamei) telah dirilis (release) secara
resmi melalui SK MenteriKelautan dan Perikanan No. KEP.41/MEN/2001 pada tanggal
14 Juli 2001. Sampai tahun 2003, budidaya udang vannamei telahmenyebar di 15
(lima belas) provinsi di Indonesia, danProvinsi Jawa Timur merupakan produsen
dan pemasok utama benur vannamei ke berbagai daerah di Indonesia.
Pada tahun yang
sama juga terjadi kematian massal udang vannamei pada beberapa area pertambakan
di Jawa Timur. Hasil uji dengan teknikPolymerase Chain Reaction (PCR)
menunjukkan bahwaudang terinfeksi Taura Syndrome Virus (TSV). Penyakit yang
disebabkan virus umumnya sangat sulitdikendalikan, seperti halnya infeksi White
Spot SyndromeVirus (WSSV) pada udang windu, TSV merupakan virus yang
menginfeksi udangvannamei dan rostris (Litopenaeus. stylirostris) yang keduanya
telahdiintroduksi di Indonesia. Serangan TSV pada umumnyaterjadi pada umur 14 – 40
hari setelah penebaran di tambak,dengan tingkat kematian dapat mencapai 95%.
Studi yang dilakukan pada saat praktek kerja lapangan terhadap kasus serangan
penyakit yang disebabkan oleh virus dilakukan di area pertambakan wilayah Pati
Jawa Tengah. Kegiatan ini merupakan tindakan pemantauan guna memonitoring
penyebaran hama penyakit ikan yang ada di Jawa Tengah. Balai Karantina Ikan,
Pengedalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas II Tanjung Emas Semarang,
merupakan unit pelaksana teknis karantina ikan yang mempunyai tugas
melaksanakan pencegahan masuk dan tersebarnya hama dan penyakit ikan karantina
dari luar negeri dan dari suatu area ke area lain di dalam negeri atau
keluarnya dari dalam wilayah negara Republik Indonesia. Balai Karantina Ikan Kelas
II Tanjung Emas Semarang, melakukan beberapa metode pemeriksaan seperti metode
pemeriksaan parasit, bakteri, jamur, dan virus secara histologi, mikrobiologi,
kimiawi maupun molekuler.
B. Rumusan Masalah
Penyakit ekor merah atau virus TSV (Taura Sindrome Virus)
yang menyerang budidaya udang vannamei dapat mengakibatkan kerugian yang sangat
besar bagi para petambak udang akibat kematian masal yang terjadi.Diagnosa
penyakit TSV dapat dilakukan melalui duametode yaitu diagnosa awal yang
merupakan pendugaan(presumptive diagnose) dan diagnosa definitif. Diagnosa
awaldilakukan berdasarkan gejala klinis. Adapun diagnosadefinitif dilakukan
untuk mendapatkan kepastian mengenaipenyebab suatu penyakit antara lain dengan
uji PCR,imunokimia dan imunohistokimia, hingga saat ini metodeyang cepat dan
sensitif adalah uji PCR. Pemeriksaan TSV terhadap udang vannamei ini sangat
diperlukan karena udang vannamei rawan terinveksi oleh virus TSV sehingga perlu
dilakukan penelitian ini.
C. Tujuan
Tujuan dari kegiatan Praktek
Kerja Lapangan yang dilakukan di Balai Karantina Ikan, Pengedalian Mutu dan
Keamanan Hasil Perikanan Kelas II Tanjung Emas adalah sebagai berikut:
1. Mengetahui
gejala klinis pada sampel udang vannamei yang terserang virus TSV.
2.
Mengetahui proses diagnosis secara molekuler
dengan menggunakan PCR.
D. Manfaat
Manfaat
dari kegiatan Praktek Kerja Lapangan yang dilakukan di Balai Karantina
Ikan,Pengedalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas II Tanjung Emas antara
lainmemberikan data dan informasi mengenai penggunaan metode PCRyang merupakan
aplikasi bidang bioteknologi molekuler yang bermanfaat untuk mendiagnosis
adanya serangan organisme patogen khususnya sindrom ekor merah pada udang
vannamei dengan menggunakan PCR yang disebabkan oleh serangan Taura Syndrome
Virus (TSV).
E. Waktu dan Tempat
Waktu
dan Tempat Praktek Kerja Lapangan ini dilaksanakan dan dimulai pada tanggal
18Februari– 03Maret 2013 di Balai Karantina Ikan,Pengedalian Mutu dan Keamanan
Hasil Perikanan Kelas II Tanjung Emas, Semarang.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Udang Vannamei ( Litopenaeus vannamei)
Udang
vannamei (Litopenaeus vannamei)adalah
salah satu spesies udang unggul yang sejak tahun2002 mulai dikultur di
tambak-tambak di Indonesia. Udang yang biasa disebut pacific white shrimp atau
rostris ini berasal dari perairan Amerika dan Hawaii. Sebenarnya ada dua
spesies udang yang dikenal sebagai pacific white shrimp yang merupakan udang
introduksi yaitu L. vannamei dan L. stylirostris. Spesies yang paling banyak di
budidayakan adalahL. vannamei. Secara ekologis udang vannamei mempunyai siklus
hidup identik dengan udang windu (Penaeus monodon) dan udang putih (P.
merguensis) yaitu melepaskan telur di tengah laut, kemudian terbawa arus dan
gelombang menuju pesisir menetas menjadi nauplius, sterusnya menjadi stadia
zoea, mysis, post larva, dan juvenil. Pada stadia juvenil telah tiba di daerah
pesisir, selanjutnya kembali ke tengah laut untuk proses pendewasaan dan
bertelur (Kordi,2011).
1. Taksonomi
Udang vannamei
Udang vannamei juga mempunyai nama F.A.O yaitu
Whiteleg shrimp, Crevette pattes blanches dan Cammaron patiblanco (Gulf States
Marine Fisheries Commmision, 2006). Klasifikasi udang vannamei menurut Boone
(1931), sebagai berikut:
Kingdom : Animalia
Filum : Arthropoda
Subfilum : Crustacea
Kelas : Malacostraca
Ordo : Decapoda
Famili : Penaeidae
Genus : Litopenaeus
Spesies : Litopenaeus vannamei
2. Morfologi
Udang Vanname
Morfologi Udang vannamei memiliki tubuh yang
berbuku dan aktifitas berganti kulit luaratau eksoskeleton (moulting) secara
periodik. Tubuh udang terdiri dari kepala danabdomen, bagian kepala terdiri
dari antenula, antena, mandibula dan 2 pasang maxillae, kepala udang dilengkapi
dengan 3 pasang maxilliped dan 5 pasang kaki jalan (periopoda) dan atau kaki
sepuluh (decapoda). Maxilliped sudah mengalami modifikasi dan berfungsi sebagai
organ untuk makan endopodite kaki jalanmenempel pada cephalothorax yang
dihubungkan dengan coxa, bentuk periopoda beruas-ruas yang berujung pada bagian
dactylus. Dactylus ada yang berbentuk capit (kaki ke-1, ke-2 dan ke-3) dan
tanpa capit (kaki ke-4 dan ke-5). Abdome terdiri dari 6 ruas. Pada bagian
abdomen terdapat 5 pasang kaki renang (pleopode) dan sepasang uropode yang
berbentuk kipas bersama-sama telson (Haliman dan Adijaya, 2005 dalam Nuraini
2008).
3. Kebiasan
Makan
Kebiasaan makan dan cara makan (Feeding and
Food Habit)udang vannamei identik dengan udang windu yaitu tergolong udang
omnivorous scavanger, pemakan segala ( hewan , tumbuhan dan bangkai. Jenis
makanan yang di makan oleh udang vannamei antara lain plankton alga bentik,
detritus dan bahan organik lainya yang membedakan dengan udang windu adalah
pada udang vannamei lebih rakus ( piscivorous) dan membutuhkan
proteinyang lebih rendah( Kordi,2011).
4. Lingkungan
Hidup
Lingkungan Hidup optimal yang menunjang
pertumbuhan dan sintasan atau kelangsungan hidup udang vannamei memiliki
toleransi yang sangat luas terhadap perubahan lingkungan , seperti salinitas
0,1-60 ppt ( tumbuh dengan baik 10 – 30 ppt, (ideal 15 – 25 ppt) dan suhu 12 –
37 0C ( tumbuh dengan baik pada suhu 24 – 34 0C dan ideal pada suhu 28 – 31 0C)
( Kordi,2011).
B. Taura Syndrome Virus(TSV)
1. Epidemologi
TSV
Taura sindrommuncul pada tahun 1994. Taura sindrom
pertama kali muncul pada kegiatan akuakultur yang dilakukan di wilayah Hawaii
dan Arizona dan dikenal hingga sekarang sebagai Taura Syndrome Virus (TSV).
Para peneliti di University of Arizonatelah menyimpulkan bahwa TSV sebagai
penyebab langsung penyakit Taura Syndrome. Taura Syndrome baik Penaeus vanname idan
P.stylirostris namun Virus dapat menginfeksi dengan ekspresip enyakit dan keparahan
gejala yang berbeda dimasing-masing.Secara umum, P.stylirostrisjauh lebih tahan
terhadap TSV dibandingkan dengan P.vannamei.
Kasus serangan TSV pada P.stylirostris pada udang
masih bisa berhasil dipanen dan dijual oleh
petani dengan praktek manajemen yang
baik.Sebaliknya, kasus serangan pada P.vannamei oleh virus TSV dapat
menyebabkan tingkat kematian yang tinggi antara75-80%, secara signifikan mempengaruhi
ekonomi masyarakat pembudidaya (CTSA, 1996). Penyakit yang disebabkan oleh TSV
sering disebutTaura Syndrome Disease atau disebut juga “penyakit ekormerah”.
Infeksi TSV bersifat sistemik, pertama kal idilaporkan dari tambak udang di
sekitar Sungai Taura,Ekuador pada tahun 1992. Penyakit TSV dengan cepat menyebar
ke sentra pengembangan budidaya udang vannamei lainnya di benua Amerika, dan
beberapa negara Asia sepertiCina dan Taiwan. Penyakit TSV telah mengakibatkan
dampakyang serius pada industri budidaya udang vannamei di sebagian besar
negara yang membudidayakan udang tersebut, termasuk Indonesia. Pada awal tahun
2003, Laboratorium Riset Kesehatan Ikan Pasar Minggu bekerja sama dengan Balai Budidaya
Air Payau Situbondo, berhasil mendeteksi adanya infeksi penyakit TSV dari
puluhan sampel udang vannamei dari sentra budidayayang mengalami kematian
massal (Direktorat Kesehatan Ikan dan Lingkungan, 2005).
2. Biologi
TSV
Taura
sindrome Virus adalah virus RNA yang sangat kecil. TSV memiliki virion dengan
diameter 31-32 nm, berbentuk icosahedron tidak memiliki anvelope dengan buoyant
density of 1.338 g/ml. GenomTSVterdiri dari, linearpositif-sense RNA beruntai
tunggal dari 10.205 nukleotida, termasuk poli-A ekor3', dan berisi dua open
reading frames (ORFs). ORF1mengandung motif urutan untuk protein nonstruktural, seperti helikase, protease,
dan RNA-dependent RNA polimerase. ORF2berisi urutan untuk protein struktural TSV,
termasuk tiga protein kapsid, besar VP1VP2 dan VP3(55, 40, dan 24kDa,
masing-masing). Virus bereplikasi dalam sitoplasma sel inang. Berdasarkan karakteristiknya,
TSV telah ditetapkanoleh International Cripavirus dan Committee Virus
Taxonomy(ICVT) merupakan genus baru kegenus dalam keluarga Dicistroviridae dalam
superfamili Picoranviruses (Lightner, 2004).
3. Mekanisme
serangan TSV
TSV
merupakan virus yang menginfeksi udang vannamei dan rostris (L. stylirostris)
yang keduanya telah diintroduksi di Indonesia. Serangan TSV pada umumnya
terjadi pada umur 14 – 40 hari setelah penebaran di tambak, dengan tingkat
kematian dapat mencapai 95%. Apabila penyakit terjadi pada umur 30 hari
pertama, berarti infeksi berasal dari induk (vertikal), jika lebih dari 60 hari
berarti infeksi berasal dari lingkungan (horisontal). Udang vannamei dewasa
dapat terinfeksi TSV, namun tingkat kematiannya relatif rendah. Infeksi TSV ada
2 (dua) fase, yaitu fase akut dan kronis. Pada fase akut akan terjadi kematian
massal. Udang yang bertahan hidup dari serangan penyakit TSV, akan mengalami
fase kronis. Pada fase kronis, udang mampu hidup dan tumbuh relatif normal,
namun udang tersebut merupakan pembawa (carrier) TSV yang dapat ditularkan ke
udang lain yang sehat ( Direktorat Kesehatan Ikan dan Lingkungan, 2005).
C.
Polymerase
Chain Reaction (PCR)
Menurut
Koesharyani (2001), PCR termasuk metode deteksi penyakit secara molekuler yang
efektif dan efisien, yaitu dengan cara perbanyakan fragmen DNA spesifik tanpa
bantuan sel bakteri. Teknik ini merupakan teknik enzymatik secara invitro untuk
memperbanyak fragmen DNA dengan memperpanjang primer secara stimultan pada
strand DNA yang teramplifikasi sekitar 2 kali lebih dari banyak setiap siklus.
Pemeriksaan dengan metode PCR terdiri dari tiga tahapan. Proses ini bermula
dari ekstraksi DNA/RNA sampel untuk penyedia cetakan, Amplifikasi DNA/RNA
dengna bantuan mesin PCR (thermocycler) dan analisa hasil amplifikasi dengan
elektroforesis, pewarnaan DNA dan dokumentasi. (Surfianti, 2010).Pendekatan
yang dapat dilakukan adalah melalui pemanfaatan teknik polymerase chain reaction
(PCR) yang bekerja secara spesifik dan sensitif. Teknik PCR dapat digunakan
untuk mendeteksi virus pada udang yang dibudidayakan. Virus yang menginfeksi
udang dalam jumlah sedikit dan belum menimbulkan gejala penyakit pada udang
dapat dideteksi dengan menggunakan teknik tersebut. Keberadaan virus dapat
dilacak sejak dini karena DNA/RNA virus yang jumlahnya sedikit dapat digandakan
dengan PCR sehingga keberadaannya dapat segera terlacak ( Dwinanti, 2009)
Proses
PCR, memerlukan:
a. DNA
cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan
b. oligonukleotida
primer yang berupa oligonukleotida pendek (18-30 basa nukleotida) dan merupakan
unsur penting untuk mencapai sensitivitas dan spesivitas dalam proses
amplifikasi (Fuadi, 2010).
Tang
& Lightner dalam Mekata (2012), penyakit virus sangat sulit untuk dikontrol
setelah timbulnya infeksi karena pada prophylaxes. Untuk mencegah atau
mengurangi kerugian dilakukan pendeteksian secara vertikal maupun horizontal.
Berbagai metode telah berkembang untuk mendeteksi virus termasuk bioassay,
histopathologi, dot blot dengan hybridisasi in situ, Polymerase Chain Reaction
secara insitu maupun realtime PCR. Reaksi dalam PCR Menurut Wuryastuti (2002)
pada dasarnya teknik PCR pada setiap siklusnya terdiri dari tiga tahap reaksi
yaitu: a. Denaturation DNA, yaitu pemecahan DNA terget dari untai ganda DNA
(dsDNA) menjadi dua untai tunggal yang identik. Proses denaturasi dapat secara
mudah dicapai dengan pemanasan secara cepat yang diikuti dengan pendinginan
secara cepat pula. Secara umum untai ganda DNA akan mengalami denaturasi pada
suhu sekitar 940 C. Waktu denaturasi yang baik untuk setiap putaran berkisar
antara 30 detik sampai 2 menit. Waktu denaturasi yang optimal untuk beberapa
macam cetakan adalah 1 menit. b. Annealing, yaitu perlekatan primer kepada DNA
untai tunggal. Dalam tahap ini, temperatur harus diturunkan secepat mungkin
untuk mencegah terjadinya perlekatan kembali antara untai tunggal DNA. Suhu dan
waktu annealing berperan penting dalam menentukan spesifisitas dan sensifitas
dari reaksi. Pada suhu 600C primer akan menempel pada pangkal dan ujung dari
masing-masing DNA untai tunggal yang komplementer sehingga mengapit suatu
daerah tertentu dari sequence DNA target. Waktu yang umumnya dipergunakan dalam
proses primer annealing berkisar antara 0,5 - 2 menit. c. Extension, yaitu
pemanjangan primer dengan bantuan enzime Taq Polymerase menggunakan rantai
komplementer sebagai template dan deoksiribonukleotida sebagai bahan untuk
membentuk untai DNA yang lengkap. Kisaran temperatur untuk proses perpanjangan
primer adalah 750-800C, sedangkan temperatur optimal adalah 720. Sehingga pada
akhir proses ini, akan terbentuk 2 buah DNA untai tunggal yang baru yang
komplementerhadap sekuen (urutan) DNA target.
BAB III
MATERI
DAN METODE
A.
Materi
Materi
yang digunakan dalam Praktek Kerja Lapangan (PKL) ini meliputi udang uji yaitu
udan vannamei (Litopenaeus vannamei)
dengan berat rata-rata 2 gram yang berasal dari hasil kegiatan pemantauan atau
survey HPI dan HPIK dari area tambak di wilayah Pati,Jawa Tengah.
1. Sampel
udang uji
Udang
yang digunakan dalam Praktek Kerja Lapangan adalah udang vannamei(Litopenaeus
vannamei) yang diduga telah terinveksi viral disease dan diperoleh dari area
pertambakan di wilayah Pati, Jawa Tengah
2. Alat
Alat-alat
yang digunakan dalam pemeriksaan TSV dengan metode PCR adalah sebagai berikut :
Alat-alat yang digunakan dalam pemeriksaan TSV dengan metode PCR
·
Micro centrifuge berfungsi untuk mencampurkan
larutan (homogen)
·
Vortex mixer
berfungsi untuk mencampurkan larutan
·
Timbangan analitik
·
Heating block
·
Mikropipet 0,001 g berfungsi untuk menimbang
sampel dan bahan Memanaskan larutan 100 – 1000µm, Mengukur volume larutan 20
-100µm, 10 – 20µm,dan 0,5 – 10 µm.
·
Disetting set berfungsi untuk menggunting dan
menempatkan sampel
·
Thermal cycler berfungsi untuk reaksi PCR
·
UV transilluminator berfunsi sebagai pembaca
hasil pada sel agarose
·
Freezer -200 C berfungsi untuk menyimpan
reagen dan sampel uji
·
Mesin Electrophoresis with Power Supply
·
Digital Photo System berfungsi sebagai pembacaan
hasil pada sel agarose - Visualisasi hasil elektroforesis
·
Tube ependorff berfungsi sebagai tempat
sampel 10
·
Microtube 100 – 1000µm, berfungsi sebagai tempat
sampel 20 -100µm, 10 – 20µm,dan 0,5 – 10 µm.
·
Penggerus Plastik berfungsi sebagai penggerus
sampel
·
Masker dan Glove berfungsi sebagai pelindung
muka dan tangan.
3.
Bahan
Bahan
yang digunakan dalam pemeriksaan TSV dengan metode PCR adalah sebagai berikut:
·
Udang Vannamei
·
Bahan Ekstraksi 5 ekor RNA Sebagai sampel
yang di uji 500µl Sebagai reagen ekstraksi (RNA Ekstraction Solution)
·
Alkohol 95% 50 ml sebagai medium pengawet
sampel
·
Isopropanal
200µl sebagai medium pelarut pada proses ekstraksi.
·
Chloroform
·
100µl
Primer Kit TSV (IQ 2000) sebagai pelarut pada proses ekstraksi Sebagai Reagen
pada proses Reagem pada proses ekstraksi.
·
TAE
Buffer 1X 500µl sebagai amplifikasi.
·
DEPC
ddH2O
·
DNA Marker
·
Agarose
500µl Pelarut pellet RNA sebagai kontrol
TSV 500µl sebagai cetakan tempat pembacaan hasil elektoforesis
·
Loading Dye 6X
·
Ethidium Bromide 5µl 100 ml sebagai pemberat
larutan Sampel Sebagai pemuncul warna pada proses UV transiluminator
·
Aquades Steril 600 ml sebagai pengencer
kepekatan Ethidium Bromide.
B. Metode
Metode
yang digunakan dalam Praktek Kerja Lapangan ini menggunakan metode survey
melalui pengambilan sampel pada lokasi secara langsung yang selanjutnya
dilakukan pemeriksaan terhadap udang yang diduga terserang virus. Lokasi tempat
pengambilan sampel yaitu area tambak di wilayah Pati, Jawa Tengah yang
merupakan daerah pemantauan yang sebelumnya telah dilakukan monitoring hama
penyakit ikan dan kemudian dilakukan pemeriksaan secara biomolekuler. Data yang
di ambil merupakan data primer dan data sekunder. Data Primer meliputi gejala
klinis udang vannamei (Litopenaeus
vannamei) yang diduga terserang virus serta pembacaan hasil dari proses
PCR. Data sekunder merupakan data yang diperoleh dari instansi yang berkaitan
dengan Praktek Kerja Lapangan di Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan
Keamanan Hasil Perikanan Kelas II Tanjung Emas, Semarang.
1. Prosedur
Pemeriksaan TSV dengan Metode PCR
Prosedur
dalam pemeriksaan KHV dengan metode PCR sesuai dengan Instruction Manual
IQ2000TM (Farming Intelligence Corp, 2003), yang dilakukan adalah sebagai
berikut:
a. Penanganan
sampel uji
Tahap
awal yang dilakukan adalah melihat kenampakan sampel udang yang diduga terkena
serangan virus, kemudian segera menyiapkan seluruh alat yang akan digunakan
untuk pemeriksaan. Pemeriksaan dilakukan dengan kadaan steril agar tidak
terjadi kontamisi seperti halnya penggunaan pinset atau gunting yang berbeda
pada masing–masing sampel yang akan di uji. Bahan uji diambil dari udang dengan
cara mengambil bagian organ pleopode, periopode, insang dan ekor dengan
menggunakan gunting dan pinset. Organ target yang telah diambil selanjutnya
disimpan dalam alkohol 95% kemudian dilakukan pemberian label atau pengkodean
sampel pada masing-masing tube sesuai dengan nomor contoh. Selanjutnya disimpan
sampel pada suhu -200C dalam freezer.
b. Tahapan
ekstraksi RNA
Tahap ekstraksi RNA ini menggunakan prosedur
ekstraksi DTAB-CTAB solution (Kit IQ2000TM). Meletakan pleopoda, periopoda,
atau insang sebanyak 2 pieces (20 mg), 30 ekor untuk ukuran udang < PL 12
atau PL 12 – 20 kemudian masukan ke dalam tube dengan ukuran 1,5 ml. Kemudian
tambahkan 500 µm RNA Extraction Solution ke dalam microtube dan hancurkan
sampel dengan menggunakan pestel hingga tercampur rata dan kemudian diamkan
pada suhu ruang selama 5 menit. Tambahkan 100µm cloroform (CHCl3) kemudian
vortex selama 20 detik dan diamkan dalam suhu ruang selama 3 menit. Setelah itu
masukan microtube ke dalam mesin sentrifuge dengan kecepatan 12000rpm selama 15
menit. Setelah proses sentrifus selesai pindahkan supernatan sebanyak 200µl
kedalam microtube baru dengan ukuran 1,5 ml dan tambahkan isopropanol, tahap
selanjutnya memvorteks dan mensentrifus kembalidengan kecepatan 12000rpm selama
10 menit. Setelah proses sentrifus ke dua selesai kemudian buang isopropanol
yang ada pada tabung akan terlihat lapisan tipis ataupun endapan putih berada
pada dasar maupun dinding tabung lapisan tersebut adalah pellet yang berisi
untaian RNA. Selanjutnya mencuci pellet tersebut dengan menggunakan ethanol 75%
sebanyak 500µm lalu sentrifuskembali dengan kecepatan 7500rpm selama 5 menit.
Setelah proses sentrifuge terakhir telah dilakukan maka ethanol yang ada pada
tube dibuang kemudian keringkan pellet pada suhu ruang. Setelah pellet
mengering dilakukan pemberian DEPC ddH2O sebanyak 500µm untuk melarutkan
pellet. Pellet RNA telah siap digunakan untuk proses selanjutnya atau dapat
dilakukan penyimpanan dengan suhu -200oC.
c. Tahapan
amplifikasi
Sebelum mencampur reagen, pastikan reagen
dalam keadaan cair (jangan sampai ada cairan yang menggumpal/beku) yaitu dengan
cara divorteks. Komposisi larutan kit PCR untuk deteksi TSV berdasarkan Farming
Intelligence Tech. Corp (2003), dibuat dengan mencampurkan bahan-bahan sebagai
berikut: a. Bahan reaksi FirstPCR: 8 μl/reaksi First PCR PreMix 7.0 μl x 5
sampel : 35μl Iqzyme DNA Polymerase 0.5 μl x 5 sampel : 2,5 μl RT Enzyme Mix
0.5μlx 5 sampel : 2.5μl b. Bahan Reaksi Nested PCR: 15 μl/reaksi Nested PCR
PreMix 14 μl x 5 sampel : 70μl Iqzyme DNA Polyemerase 1 μl x 5 sampel : 5 μl
Setelah semua bahan dicampur (kecuali template RNA), bagikan ke dalam mikrotube
0,2 mL dengan volume masing-masing 8 μL. Tambahkan template RNA, termasuk
kontrol positif ( RNA positif TSV) dan kontrol negatif (ddH2O), masing-masing
sebanyak 2 μL. Vorteks sebentar sebelum dimasukkan ke dalam mesin PCR
(Thermalcycler). Pastikan progam yang akan dijalankan adalah TSV. Suhu pada
Themalcycler PCR Reaksi Suhu (0oC) Waktu (detik) Jumlah Siklus First
PCR Denaturation 94 20 15 Annealing 62
40 15 Extension 72 30 15 Final Elongation 20 30 15 Denaturation 94 20 30
Annealing 62 20 30 Extension 72 30 30 Final Elongation 20 30 30 Nested PCR
Prosedur Reaksi Polymerase Chain Reaction
(PCR)
·
Disiapkan bahan campuran first PCR dan Nested
PCR yang diperlukan sesuai nomor sampel. Untuk masing-masing reaksi, dibuat
tiga positif standar (103, 102, 101) dan 1 kontrol negatif (ddH20)
·
Dilakukan pemipetan sebanyak 8 μl larutan
campuran First PCR ke dalam masing-masing tabung 0.2 ml yang telah diberi label.
·
Ditambahkan sebanyak 2 ml ekstraksi sampel
DNA atau standar ke masingmasing larutan reaksi
·
Dilakukan proses amplifikasi first PCR
·
Ditambahkan sebanyak 15 μl larutan Nested PCR
ke dalam masing-masing tabung setelah first PCR selesai
·
Dilakukan proses amplifikasi Nested PCR
·
Ditambahkan sebanyak 2 μl loading dye 6X ke
dalam masing-masing tabung setelah reaksi nested PCR selesai, kemudidan
campurkan merata
·
Dilakukan tahapan elektroforesis pada sampel
setelah bahan dicampur
d. Tahapan
elektroforesis
Tabung yang telah selesai pada tahapan
amplifikasi disiapkan dan ditambahkan 5 mL 6X loading dye pada masing-masing
tabung dan mengganti tip mikropipet untuk tiap-tiap pengambilan loading dye dan
campurkan hingga larutan homogen. Letakan Gel yang sudah gel yang sudah di
cetak kedalam tangki elektroforesis lalu tangki diisi dengan larutan TAE 1X
sebanyak 500 mL (sampai gel terendam).HasilProduk PCR yang sudah dicampur
dengan loading dye kemudian dimasukkan ke dalam sumuran gel sebanyak 5-10 mL
dengan mikropipiet. Marker atau penanda DNA yang sudah diketahui berat
molekulnya (284 bp dan 476 bp) juga dimasukkan sebanyak 5 mL. Marker diletakkan
di awal atau di akhir deretan sumuran gel. Setelah semua sampel disuntikkan
dalam sumuran, tutup elektroforesis dipasang dan listrik dihidupkan dengan
voltase diatur 100 V selama 30 menit.
e. Pengamatan
dan dokumentasi
Setelah proses electrophoresis selesai, maka
gel yang berada pada pada alat dipindahkan dengan menggunakan sarung tangan
kemudian rendam gel dalam larutan zat ethidium bromida (ETBR) 0,005 % selama 10
menit.Setelah itu angkat gel dan rendam kembali dengan menggunakan aquades
steril selama 10 menit. Amati gel diatas mesin UV Transiluminator dan
didokumentasi.
f. Pembacaan
hasil
Hasil positif TSV bila terlihat garis perpendaran pita DNA (band) dengan
ukuran 284 bp, 476 bp. Hasil negatif bila tidak terlihat garis perpendaran pita
DNA (band) atau pendaran hanya pada 848 bp.
BAB
IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A.
Hasil
Hasil
yang diperoleh dari pemeriksaan sampel udang dengan metode Polymerase Chain
Reaction (PCR) yang dilaksanakan di Balai Karantina Ikan Kelas II, Semarang
adalah sebagai berikut:
1. Gejala
klinis udang terserang viral disease
Pemeriksaan
gejala klinis selama Praktek Kerja Lapangan dilakukan pada udang vannamei yang
diduga terinfeksi virus dengan mengamati kondisi fisik udang. Pengamatan
dilakukan pada saat pengambilan sampel. Udang sampel merupakan benur udang yang
memiliki panjang 5cm yang berasal dari tambak yang dilaporkan mengalami banyak
kematian di wilayah Pati, Jawa Tengah. Pengambilan sampel dilakukan pada tambak
bp Suprio dan bp. Redi Sujoko. Secara umum kondisi benur udang pada tambak bp.
Suprio memiliki kondisi baik, terlihat dari aktifnya udang ketika dilakukan
pemberian pakan untuk mempermudah pengambilan sampel udang dengan menggunakan
anco. Berbanding terbalik dengan kondisi benur udang pada tambak milik bp. Redi
Sujoko, sebagian besar benur udang mengalami kematian dengan kondisi membusuk
didasar tambak. Udang yang masih hidup cenderung pasif dan berada pada
pinggiran tambak dan menyendiri di antara algae yang tumbuh dekat dengan
permukaan air. Udang yang masih hidup tersabar merata pada bagian pinggir
tambak. Secara rinci gejala klinis yang terjadi pada kedua tambak disajikan
pada tabel di bawah ini.
|
Gejala Klinis Udang yang Diduga
Terserang Viral Disease Tingkah Laku Kondisi
|
||
|
No
|
No Sampel Acuan Fisik Udang
|
Fisik Udang
|
|
1
|
S.04.03.0471.P
|
Aktif bergerak Normal
|
|
2
|
S.04.03.0472.P
|
Normal
|
|
3
|
S.04.03.0473.P
|
Aktif bergerak Pasif di pinggir tambak
|
|
4
|
S.04.03.0474.P
|
Pasif di pinggir tambak
|
|
5
|
S.04.03.0475.P
|
Pasif di pinggir tambak Tubuh lunak
|
Sampel
udang yang digunakan diduga telah mengalami infeksi Viral Disease yang mengacu
pada gejala klinis yang ditunjukan pada saat survey lokasi yang telah mengalami
kematian pada sebagian besar udang yang dipelihara di tambak. Untuk sampel
udang vannamei dilakukan analisis laboratorium menggunakan PCR untuk mengetahui
secara pasti akan serangan infeksi WSSV, TSV dan IMNV pada udang. Sampel udang
yang digunakan merupakan capuran sampel udang dari dua tambak tambak yang
berbeda yaitu dua ekor sampel udang berasal dari tambak bp. Suprio dan tiga
sampel udang dari tambak bp.Redi Sujoko.
2. Pemeriksaan
TSV dengan PCR
Udang
yang didiagnosis memiliki tingkah laku yang cenderung pasif dan memiliki
kondisi fisik tubuh yang lunak ketika dipegang. Pemeriksaan lanjutan yang
dilakukan pada udang vannamei setelah mengamati gejala klinis adalah
pengambilan sampel pleopoda, periopoda, insang dan ekor. Selanjutnya dilakukan
proses ekstraksi RNA agar sampel bisa digunakan pada proses PCR dan terakhir
adalah proses elektroforesis untuk mengetahui gambaran gel agarose yang
akanmenunjukan indikasi positif atau negatif infeksi TSV tersebut. Secara
lengkap proses pemeriksaan TSV dengan PCR.
Hasil
pemeriksaan TSV (metode PCR) pada gel agarose dengan menggunakan Kit IQ2000TM;
menunjukkan bahwa contoh udang yang berasal dari tambak udang di Desa Geneng
Mulyo, Kecamatan Juwana, Kabupaten Pati, terdeteksi negatif terinfeksi TSV.
Hasil dari visualisasi gel agarose pada pemeriksaan TSV menunjukan pada 5
sampel udang yang tidak terdeteksi sample tersebut terinfeksi virus TSV.
Mengacu pada intruction manual IQ 2000TM, menyatakan bahwa hasil positif TSV
bila terlihat garis perpendaran pita DNA (band) dengan ukuran 284 bp dan atau
476 bp sedangkan hasil negatif bila tidak terlihat garis perpendaran pita DNA
(band) atau pendaran hanya pada 848 bp. Keseluruhan sampel yang telah di uji
menggunakan pemeriksaan molekuler ini tidak terdeteksi telah terinfeksi virus
TSV hal ini dapat dilihat pada hasil visualisasiyang menunjukan tidak adanya
pendaran pita (band) pada ukuran 284 bp dan atau 476 bp. Tidak berpendarnya
pita dapat dimungkinkan karena buruknya kualitas RNA yang ada ataupun keteika
proses ekstraksi RNA tidak sengaja ikut terbuangsehingga tidak menunjukkan
adanya pendaran pada gel agarose.
Hasil
Pengamatan PCR pada Udang Vannamei (Litopenaeus vannamei) Kode Keterangan/ asal
sampel udang Hasil M Marker K(+) Kontrol positif (TSV) Positif K(-) Kontrol
negativ (TSV) Negatif S.04.03.0471.P Contoh Udang dari tambak Bp. Suprio Negatif
S.04.03.0472.P Contoh Udang dari tambak Bp. Suprio Negatif S.04.03.0473.P
Contoh Udang dari tambak Bp. Redi S Negatif S.04.03.0474.P Contoh Udang dari
tambak Bp. Redi S. Negatif S.04.03.0475.P Contoh Udang dari tambak Bp. Redi S.
Negatif
3. Kualitas
air
Parameter
kualitas air yang diamati dalam pemeriksaan infeksi TSV meliputi salinitas
suhu, pH, DO, CO2, dan Alkalinitas. Parameter yang menjadi perhatian adalah
suhu. Hal ini dikarenakan suhu sangat berpengaruh terhadap serangan infeksi
firus TSV dan merupakan salah satu faktor pemicu serangan TSV. Suhu berpengaruh
terhadap siklus replikasi virus.
Secara
lengkap, data pengamatan kualitas air dapat dilihat di bawah ini:
Data
Kualitas Air Tambak Pembudidaya Udang Vannamei Desa Margo Tuhu, Kecamatan Juwana,
Pati.
Baku
Mutu Air Untuk Tambak Tambak Perikanan Parameter 1 2 Nilai Acuan Warna air 0
Jernih Jernih - 0 Suhu ( C) 34 34 28-32 C SNI pemeliharaan pH 7,2 7,3 7,5 – 8,5
Kordi, 2011 DO 9 6 >3 Kordi, 2011 CO2 0 0 < 12 Kordi, 2011 Salinitas 24
32 24 –34 ppt Kordi, 2011 Alkalinitas (mg/l) 60 90 50-300 Kordi,2011 Waktu
Sampling 14.26 14.56
Cuaca Cerah Cerah Hasil pemeriksaan kualitas
air pada saat survey dilakukan menunjukan bahwa kondisi kualitas air secara
umum masih memenuhi standart kelayakan untuk proses budidaya. Dari semua
parameter yang diukur hanya salinitas air yang berbeda pada kedua tambak pada
tambak bp. Suprio memiliki salinitas 25 ppm sedangkan pada tambak bp. Redi
Sujoko memiliki salinitas 32 ppm, hal ini dapat dikarena kemungkinan sumber air
yang berbeda ataupun telah tercampurnya air tambak dengan air hujan yang
terjadi sebelum survey dilakukan.
B. Pembahasan
1.
Gejala klinis udang terserang viral disease
Sampel
udang yang akan diperiksa merupakan sampel hidup dengan gejala klinis
didasarkan pada pengamatan yang dilakukan pada saat pengambilan sampel.Udang
yang berada di dalam tambak menunjukan adanya serangan infeksi virus yang
menyerang benur udang dengan panjang rata-rata 5 cm dengan usia pemeliharaan
tiga minggu. Tingkah laku udang yang terlihat adalah sebagian besar udang
berada pada pinggiran tambak dan menyendiri cenderung diam atau pasif diantara
algae yang tumbuh dekat dengan permukaan air. Tubuh udang terasa lunak ketika
dipegang namun tidak menunjukan adanya melanisasi pada lapisan epidermis.
Pengambilan sampel ini didasarkan atas laporan
pemilik tambak yang mengalami kematian pada sebagian besar benur udang yang
telah dipelihara dan pendugaan tersebut menjadi dasar dilakukan pemeriksaan
secara biomolekuler sampel udang tersebutapakah telah terkena serangan virus
TSV, WSSV ataupun IMNV atau tidak. Menurut Surfianti (2010), Udang sampel
diambil dalam kondisi hidup, secara klinis sampel yang diambil atau akan
digunakan dalam uji telah menunjukan gejal TSV, yaitu berenang menuju pinggir tambak,
daging agak lunak, ekor kipas atau telson kemerahan, kaki renang berwarna
kemerahan dan bercak hitam (melanisasi) di bawah kutikula.
Berdasarkan Kajian dari Direktorat Kesehatan
Ikan dan Lingkungan (2005) , membagi dua indikator kemungkinan adanya infeksi
TSV, antara lain:
a. Pada
infeksi berat (akut) sering mengakibatkan kematian massal, udang yang mengalami
kematian didominasi oleh udang yang sedang/baru selesai proses pergantian
kulit(moulting), saluran pencernaan kosong dan warna tubuhkemerahan. Warna
merah yang lebih tegas dapat dilihatpada ekor kipas (telson).
b. Udang
yang selamat dari fase akut, umumnya mampu hidup dan tumbuh normal dengan tanda
bercak hitam (melanisasi) yang tidak beraturan di bawah lapisan kutikula.
2. Pemeriksaan
TSV dengan metode PCR
Pengamatan
gejala klinis pada udang sampel dilakukan sebagai diagnosis awal yang
mengindikasikan udang tersebut telah positif terinveksi TSV. Pemeriksaan dengan
mengunakan metode PCR bertujuan untuk memastikan ada atau tidak adanya infeksi
virus TSV pada tubuh udang. Pemeriksaan dengan metode PCR bertujuan untuk
melipat gandakan sekuen nukleotida tertentu secara eksponensial dalam waktu
yang singkat secara invitro.
Proses
Pemeriksaan TSV dengan menggunakan metode PCR memerlukan sejumlah siklus untuk
mengamplifikasi sekuen RNA spesifik. Setiap siklusya terdiri tiga tahap yaitu
denaturation (pemotongan), annealing (penempelan) dan extention
(pemanjangan).Pada pengujian yang dilakukan dengan menggunakan kit IQ2000TM,
marker PCR menggunakan primer spesifik KHV dengan berat molekul 848 bp, 284 bp
dan. 476 bp. Hasil positif ditunjukan apabila mucul atau berpendarnya pita atau
band pada ke tiga fragmen spesifik tersebut dan dapat digolongkan dengan
infeksi berat, apabila terjadi perpendaran pada fragmen 284 bp - 476 bp hal ini
menunjukan sampel positif terinfeksi virus TSV dengan status infeksi sedang,
apabila hanya terjadi perpendaran band pada fragmen 284 diduga sampel positif
ringan sedangakan apabila hanya terjadi perpendaran pada fregmen 848 bp atau
tidak terjadi perpendaran pada ke tiga fragmen maka hal ini menunjukan bahwa
firus TSV tidak terdeteksi pada sampel udang yang telah diuji.
Didasarkan
pada kajian Surfianti (2010), TSV memiliki genom +ssRNA dengan panjang 9 bp.
Sampel TSV yang diduga terinfeksi TSV positif ringan ditandai dengan munculnya band
pada 276 bp, sampel yang terinfeksi TSV positif sedang ditandai dengan
munculnya band pada 276 bp dan 476 bp, sedangkan sampel yang terinfeksi TSV
positif berat ditandai dengan munculnya band pada 276 bp, 476 bp dan 848 bp.
Hal ini menunjukan bahwa batasan sekuen TSV yang dikenali oleh primer adalah
848 bp. Hasil yang diperoleh adalah pada kelima sampel udang yang telah diuji
secara biomolekuler tidak terdeteksi adanya infeksi virus TSV pada benur udang.
Hal ini ditunjukan dari hasil visualisasi proses amplifikasi dan elektroforesis
yang telah dilakukan. Pada ke lima sampel tidak terlihat munculnya pendaran
band pada fragmen 276 bp, 476 bp, dan 848 bp. Hal ini dimungkinkan karena
buruknya kualitas RNA yang ada akibat tidak sesuainya sampel udang yang
digunakan ataupun DNA ikut terbuang pada proses ekstraksi sehingga dalam proses
elektroforesis tidak menunjukan pendaran pada gel agarose.
Menurut Surfianti (2010), salah satu sifat RNA
adalah mudah sekali mengalami degradasai yang dapat disebabkan oleh beberapa
hal seperti handling yang kurang baik cepat serta suhu penyimpanan yang rendah
berperan dalam menjaga kualitas maupun kuantitas sampel RNA yang disimpan. Di
dukung dengan pernyataan Surfianti (2010), bahwa tahapan ekstraksi merupakan
tahap awal dalam proses pemisahan DNA/RNA dan merupakan tahapan penting untuk
uji berikutnya, sehingga harus bebas dari kontaminasi. Menurut Dwinanti (2011),
Penggunaan teknik PCR memeilki beberapa kelemahan antara lain kemungkinan
memperoleh hasil positif maupun negatif yang salah. Hasil positif yang keliru
dapat disebabkan karena adanya kontaminasi oleh kontrol positif maupun sampel
yang lain sebelum proses amplifikasi. Hasil negatif yang salah dapat disebabkan
karena jumlah kopian DNA/RNA yang tidak mencukupi dan tingkat infeksiyang
terlalu rendah sehingga pita DNA/RNA berpendar redup atau bahkana tidak berpendar,
adanya inhibitor sehingga reaksi enzim terhambat, kerusakan mesin PCR,
kesalahan pada penggunaan atau pengaturan alat, kualitas sampel yang buruk,
serta kesalahan konsentrasi bahanbahan seperti primer dan ion Mg2+
3. Kualitas
air
Kualitas
air merupakan salah satu faktor yang dapat menyebabkan penyebaran virus TSV
pada areal. Dari hasil pengukuran kualitas air pada tambak bp Suprio dan bp.
Redi Sujoko dapat dikatakan kedua tambak tersebut memiliki kualitas air yang
baik dengan kisaran suhu keduanya 340C tingginya suhu ini
dikarenakan pengukuran dilakukan pada saat matahari terik, Salinitas 25 - 32
ppm, DO 9 mg/l, pH 7,2 – 7,3, CO2 0 mg/l, dan alkalinitas 60 – 90 mg/l.
Lingkungan Hidup optimal yang menunjang pertumbuhan dan sintasan atau
kelangsungan hidup udang vannamei memiliki toleransi yang sangat luas terhadap
perubahan lingkungan , seperti salinitas 0,1-60 ppt ( tumbuh dengan baik 10 –
30ppt, (ideal 15 – 25 ppt) dan suhu 12 – 37 0C (tumbuh dengan baik
pada suhu 24 – 34 0C) dan ideal pada suhu 28 – 31 0C) ( Kordi,2011).
Disamping kualitas air yang harus di perhatikan, sistem budidaya turut andil
dalam proses penyebaran virus pada area pertambakan disuatu daerah, ketika
dilakukan pengambilan sampel udang di area tambak desa Margo Tuhu, hampir semua
pertambakan menerapkan sistem tambak tradisional maupun sistem semi intensif.
Hal ini merupakan salah satu faktor cepatnya penyebaran penyakit viral. Sistem
pertambakan yang baik untukpengendalian penyakit TSV adalah sistem semitertutup
(semi closed system) dan tertutup (closedsystem), sehingga desain dan
konstruksi harusdisesuaikan. Tambak yang ideal terdiri dari petakanpemeliharaan
dan petakan tandon, sertadilengkapidengan saluran inlet dan outlet yang
terpisah. Hal ini perlu dilakukan untuk menjaga sistem pertambakandari
kemungkinan masuknya patogen dari luar dan keluarnya patogen dari dalam ke luar
sistem. Cara lain untuk menghindari resiko infeksi virus dapat dilakukan dengan
pergiliran pola tanam atau mengistirahatkan tambak untuk jangka waktu tertentu.
(Direktorat Kesehatan Ikan dan Lingkungan , 2005).
BAB V
PENUTUP
A.
Kesimpulan
Kesimpulan
yang dapat diambil dari hasil Praktek Kerja Lapangan yang dilakukan adalah
sebagai berikut:
1. Gejala
klinis udang vannamei yang diduga terinfeksi TSV diantaranya adalah memiliki
gejala klinis seperti tubuh lunak dan memiliki tingkah laku yang cenderung
pasif di pinggir tambak. Sebagian besar udang yang berada di tambak milik bp
Redi Sujoko berada pada pinggiran tambak dan cenderung diam dan tersebar merata
di antara alga yang tumbuh pada pinggiran tambak.
2. Pemeriksaan
biomolekuler dengan menggunakan PCR untuk memastikan dan mendeteksi adanya
virus RNA yang mengindikasikan bahwa kematian udang yangterjadi disebabkan oleh
serangan virus TSV memberikan hasil negatif, hal ini memberikan indikasi bahwa
diagnosa dengan pendekatan biomolekuler tidak selalu sejalan dengan tanda-tanda
klinis. Metode analisis biomolekuler tersebut pada setiap siklusnya terdiri
dari tiga tahapan yaitu proses denaturasi, annealing, dan extention.
Berdasarkan analisis PCR yang dilakukan terhadap 5 sampel yang terdiri dari 2
sampel udang dari tambak bp. Suprio dengan kode sampel S.04.03.0471.P dan
S.04.03.0472.P
3.
sampel udang dari tambak bp. Redi sujoko
dengan kode sampel S.04.03.0473.P, S.04.03.0473.P, dan S.04.03.0475.P
memberikan hasil negatif.
B.
Saran
Saran
yang dapat diambil dari hasil Praktek Kerja Lapangan yang dilakukan adalah
sebagai berikut:
1. Pada
saat pengambilan sampel hendaknya teliti dalam mengamati ciri-ciri fisik maupun
tingkah laku udang yang diduga terserang viral disease agar tidak terjadi
kekeliruan dalam pendiagnosisan secara molekuler.
2. Dalam
pengujian sampel dengan menggunakan PCR hendakanya dilakukan secara hati-hati
dan teliti agar hasil akhir proses ini dapat divisualisasikan dengan baik untuk
menentukan positif atau tidaknya sampel udang terinfeksi TSV. Sampel yang
digunakan hendaknya telah menunjukan gejala-gejala umum serangan virus TSV
karena disini merupakan dugaan awal agar proses PCR tidak sia-sia dilakukan.
